High-throughput Screening for Defense Priming-inducing Compounds in Parsley Cell Cultures

BIO-PROTOCOL, vol. 11, pp. e4200

Abstract

Defense priming describes the enhanced potency of cells to activate defense responses. Priming accompanies local and systemic immune responses and can be triggered by microbial infection or upon treatment with certain chemicals. Thus, chemically activating defense priming is promising for biomedicine and agriculture. However, test systems for spotting priming-inducing chemicals are rare. Here, we describe a high-throughput screen for compounds that prime microbial pattern-spurred secretion of antimicrobial furanocoumarins in parsley culture cells. For the best possible throughput, we perform the assay with 1-ml aliquots of cell culture in 24-well microtiter plates. The advantages of the non-invasive test over competitive assays are its simplicity, remarkable reliability, and high sensitivity, which is based on furanocoumarin fluorescence in UV light., [抽象的] 防御启动描述了细胞激活防御反应的增强效力。引发伴随局部和全身免疫反应，可由微生物感染或在用某些化学物质处理时触发。因此，化学激活防御启动对于生物医学和农业是有希望的。然而，用于检测引发引发化学物质的测试系统很少见。在这里，我们描述了一种化合物的高通量筛选，这些化合物在欧芹培养细胞中引发微生物模式刺激抗菌呋喃香豆素的分泌。为获得最佳通量，我们在 24 孔微量滴定板中使用 1 毫升细胞培养物进行检测。与竞争性检测相比，非侵入性检测的优势在于其简单性、卓越的可靠性和高灵敏度，这是基于紫外光下的呋喃香豆素荧光。 [背景] 由于人口增长、耕地减少和气候变化导致的紧迫的全球粮食不安全问题只能通过有效的作物保护在农业中得到解决（联合国粮食及农业组织，2009 年）。合成农用化学品可以有效保护作物免受病害，但也会引起生态和健康问题（Lamberth等，2013；Mascarelli，2013）。因此，需要安全环保的疾病控制产品（Lamberth等，2013）。 启动植物免疫系统以增强防御能力的化学品有望实现可持续的作物保护（Beckers 和 Conrath，2007 年；Conrath等人，2015 年）。当被激发时，植物对非常低的病原体刺激做出反应，比未激发的植物更强大的防御激活。这通常会降低已引发植物的疾病易感性并降低病原体适应的风险（Conrath等，2002、2006 和 2015；Beckers 和 Conrath，2007；Frost等，2008）。因此，通过无害的化学品诱导引发是可持续作物病害控制的一种有前途的手段。之前对几种化合物的研究证明了这一概念（Conrath等人，2015 年总结）。然而，这些化合物的经济成功是有限的，主要是因为农民更喜欢标准杀虫剂的强大疗效。 如今，作物保护剂的商业成功通常依赖于它们将抗菌活性与目标作物的防御启动相结合的能力（Beckers 和 Conrath，2007 年；Conrath等人，2015 年）。然而，用于识别引发诱导化学的直接测试系统很少见。在这里，我们描述了一种高通量筛选，用于识别在悬浮培养的欧芹 ( Petroselinumcrispum ) 细胞中引发微生物模式诱导的呋喃香豆素 (植物抗毒素) 分泌的化合物。该测试测量了中等浓度的 Pep13（Kauss等人，1992 年），一种植物病原体大豆疫霉中的分子模式肽（Brunner等人，2002 ）。在过去的 25 年中，该测试有助于识别新的引发诱导化学（Katz等人，1998 年；Siegrist等人，1998 年；Schillheim等人，2018 年）。为了获得更高的通量，我们现在在 24 孔微量滴定板中使用 1 mL 细胞培养物进行测试（Schillheim等人，2018 年）。与竞争性测定相比，该测试的其他优势是荧光检测的非凡可靠性、简单性和高灵敏度，并且在最终分析之前只需要两个简单的处理（启动和 Pep13 挑战）。原则上，该测定也应该适用于合成呋喃香豆素的其他植物物种（例如，巨型猪草、普通猪草和花园当归）的细胞培养物，前提是它们对用特定分子模式的处理产生反应，并分泌到培养物中的呋喃香豆素中等的。如果不是这种情况，则需要选择其他测试读数 [例如，活性氧的产生，如 Kauss等人所述。(1994)]。最近引入的对此处介绍的屏幕的竞争性测定评估了丁香假单胞菌pv的增强。番茄avrRpm1通过引发剂诱导拟南芥细胞培养物中的细胞死亡（Noutoshi等，2012）。几种免疫引发化合物的鉴定证实了该测定法在发现引发诱导化学方面的能力。然而，由于细菌挑战、细胞化学染色、洗涤、染料提取和吸光度测量的要求，筛选非常复杂。对于最近用于发现免疫启动化学的呼吸活动监测系统也是如此（Schilling等，2015），该系统具有高度创新性，但吞吐量低。

Authors 2

1. Kathrin Schmitz Aachen Plant Biochemistry and Molecular Biology Group Department of Plant Physiology

   RWTH Aachen University

   Affiliation as printed

   Plant Biochemistry & Molecular Biology Group, Department of Plant Physiology, RWTH Aachen University, Aachen 52074, Germany

2. Uwe Conrath Aachen Plant Biochemistry and Molecular Biology Group Department of Plant Physiology

   RWTH Aachen University

   Affiliation as printed

   Plant Biochemistry & Molecular Biology Group, Department of Plant Physiology, RWTH Aachen University, Aachen 52074, Germany